基因工程(第三版)

作者：本书编写组

页数：336

出版社：科学出版社

出版日期：2022

ISBN：9787030410917

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内容简介

《基因工程(第三版)》为普通髙等教育“十一五”国家最规划教材，在前两版多年使用的基础上修订而成。《基因工程(第三版)》按照基因工程的技术路线，对核酸的制备、基因工程工具酶、基因克隆载体、目的基因的分离与修饰、重组基因导人受体细胞、外源目的基因表达与调控等进行了详细的描述。同时，根据基因工程的发展趋势，对基因组改造、蛋白质工程、代谢工程等进行了简要的介绍。

目录

节选

第一章 核酸的制备 核酸包括脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid， DNA)和核糖核酸（ribonucleic acid， RNA)两大类。核酸是生物的遗传物质，它决定着生物的遗传性状。核酸是基因工程研究的对象和原始材料，目前巳建立了一系列针对不同生物核酸的制备方法。核酸制备的基本操作过程包括生物材料的准备、细胞的裂解、DNA或RNA的提取与纯化，以及对核酸样品的检测与分析。 第一节核酸的组成与结构 为了有效地制备核酸分子，并在后续的基因工程操作中准确地掌握相关操作技术，首先要了解核酸的相关基础知识。 一、DNA的组成与结构 (一)DNA的组成 DNA是一类由4种脱氧核苷酸按照一定的顺序聚合而成的生物大分子。例如，人的各条染色体DNA分子平均含有约1.3X108个碱基对（bp)。即使是一些很小的质粒，它的 DNA分子也含有成千个碱基对，如从蓝藻中分离出的一种小质粒pPbS就含有1511bp。 脱氧核苷酸分子由脱氧核糖、磷酸和碱基组成。脱氧核糖的第一位置碳原子（1’）上连接一个碱基，第五位置碳原子（5’）上连接一个磷酸基团。脱氧核苷酸的5’磷酸基团和另外一个脱氧核苷酸的3’羟基结合形成磷酸二酯键，把两个脱氧核苷酸连接在一起。按此方式把一个一个脱氧核苷酸连接成多聚脱氧核苷酸，其一端为游离的5’磷酸基团（5′-P)，称为5端；而另一端为游离的3羟基（3-OH)，称为3端（图1-1)。 组成DNA的碱基有腺嘌呤（A)、鸟嘌呤（G)、胞嘧啶（C)和胸腺嘧啶（T)4种，分别含有这4种碱基的脱氧核苷酸依次称为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。多聚脱氧核苷酸链中，各个脱氧核苷酸的脱氧核糖和磷酸基团的结构和位置是一致的，不同的只是碱基。因此在多聚脱氧核苷酸链中，碱基的顺序表示脱氧核苷酸的序列。例如，从5’端开始依次由鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、腺嘌呤脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸连接成的寡聚核苷酸链可用碱基5′-GCCAT-3’表示。 (二）DNA的空间结构 DNA通常以两条相同的多聚脱氧核苷酸链反向结合的形式存在，两条脱氧核苷酸链总是按照碱基A与T互补配对、G与C互补配对，通过氢键形成稳定的双螺旋结构，称为双链DNA (dsDNA，图1-1)。而单独存在的一条多聚脱氧核苷酸链称为单链DNA (ssDNA).自然界存在的DNA绝大部分是双链DNA，只有部分病毒和噬菌体及绝少数质粒的DNA是单链DNA。 由于双链DNA中碱基是互补配对的，所以当一条链的核苷酸序列巳知时，另外一条链的核苷酸序列也就可以知道。为便于书写，双链DNA的核苷酸序列往往以5，—3，走向的单链DNA的核苷酸序列表示。例如，DNA片段 5′-GATCATGCCATC-3′ 3′-CTAGTACGGTAG-5′ 可写成5′-GATCATGCCATC-3’。 图1-1 DNA的一段多聚脱氧核苷酸链示意图 根据DNA双螺旋结构的螺距和旋转方向不同，可以分为B-DNA、A DNA、Z DNA。但生物体内的DNA绝大部分是以B-DNA形式存在的。因此，如果没有专门说明是哪一种 DNA，一般所说的DNA是指B-DNA。B-DNA的空间结构见图1-2。 由于双链DNA是靠互补配对的碱基之间的氢键维持的，因此当溶解在溶液中的双链 DNA处于较高温度条件下时，氢键断开而解链成单链DNA，此过程称为DNA变性。DNA 溶液加热到90°C时，就足以使DNA完全变性。DNA达到50%变性的温度称为解链温度(Tm)。Tm与DNA分子中G+C的含量成正相关。高温变性的DNA被逐渐冷却时，分开的两条单链又会重新结合成双链DNA，此过程称为复性。在复性条件下，即使不是同一个 DNA分子变性产生的两条单链，只要它们之间的碱基序列大部分是互补的，同样可以复性。甚至DNA与RNA之间，如果序列中碱基互补（除G与C配对外，RNA的U与DNA的 A配对），复性条件下也同样可以互相结合，成为双链杂交分子。 (三)DNA在生物体内的存在状态 处于生物体内的DNA称为天然DNA，包括染色体DNA、病毒DNA (噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA等，有的以线形存在，有的以环状存在。几乎所有真核生物的染色体DNA都是线形DNA，部分原核生物的染色体DNA也是以线形存在的。而大部分原核生物的染色体DNA和全部线粒体DNA、叶绿体DNA及细菌的质粒DNA全是环状DNA分子。病毒和噬菌体中有的含线形DNA，有的含环状DNA。X噬菌体的DNA 处在噬菌体颗粒内时是线形的，当X噬菌体进入宿主细胞后，脱去外壳，两端连接就成为环状的DNA分子。环状DNA分子一般以超螺旋形式存在，称为超螺旋DNA (supercoiled DNA，sc-DNA)或共价闭合环状 DNA (covalently closed circular DNA，cccDNA)；当 DNA —条链的一个憐酸二醋键断开时，则成为开环DNA分子（open circle DNA，oc-DNA)；而当两条链中相对应的两个磷酸二酯键同时断开时，则成为线形DNA分子（linear DNA，1-DNA)。提取的质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳检测时，凝胶上经常可以同时观察到 ccc-DNA、 oc-DNA 和1-DNA。 (四)DNA的生物学功能 1.DNA是遗传信息库 每个DNA分子编码着为数不等的各种基因（gene)。基因是DNA分子中一个由多个核苷酸按特定排列顺序组成的DNA区段，是遗传物质的最小功能单位，决定着生物体内某种蛋白质和RNA的合成。一个DNA分子可编码多个基因，一般而言原核生物的DNA分子编码的基因数少，真核生物的DNA分子编码的基因数多。因此，DNA分子是绝大部分生物（RNA病毒除外）遗传信息的载体，储存着决定这些生物不同物种的所有蛋白质和RNA 的全部遗传信息，使其在不同时间和空间有序地合成生物体的相关组分，为其生命周期自始至终有序地进行和个性发展奠定了物质基础。 2.DNA能转录RNA 一个DNA分子中，有的核苷酸序列（RNA基因）转录出rRNA，成为核糖体的一部分；有的核苷酸序列（RNA基因）转录出tRNA，在蛋白质合成过程中转运氣基酸；有的核苷酸序列（结构基因）转录出mRNA，把DNA的遗传信息传递给以后翻译合成的蛋白质。此外，在转录过程中往往还出现种种小RNA分子。但是DNA分子中还有一部分核苷酸序列是不转录任何RNA的，特别是高等真核生物染色体DNA分子中的大部分核苷酸序列是不转录任何RNA的。行使转录RNA的DNA核苷酸序列有转录启动子和转录区两部分。转录启动子（promoter，P)是指DNA上一段能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的核苷酸序列。转录区从转录RNA的起录点开始，包括基因编码区和转录终止子。所有生物从最低等的病毒直至人类，蛋白质合成都使用同一套遗传密码（表1-1)，只有极少数例外，也就是说遗传密码是通用的。重组的DNA分子不管导人什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，其上面的遗传密码均能转录翻译出同样的氨基酸。即使人工合成的 DNA分子（基因），其上面的遗传密码同样可以转录翻译出相应的氨基酸。 表1-1 编码氨基酸的通用遗传密码子 3. DNA分子能在细胞内复制 在细胞分裂之前，细胞内的DNA分子能进行半保留复制（semi conservation replica-tion)。复制过程中，亲代双链DNA分子的每一条链准确地按核苷酸互补配对原则，在 DNA聚合酶催化下各合成一条新的互补链，由此产生的两个新DNA分子的核苷酸序列与原来的DNA分子完全相同。复制结束后，两个新DNA分子分别进人分裂后的子细胞内，每个子细胞内的DNA分子携带着同细胞分裂前亲代细胞内的DNA分子完全一样的遗传信息。这种复制方式称为半保留复制，可使DNA携带的遗传信息精确地传代，除非是在 DNA复制过程中发生了突变。DNA的复制是边解链边合成的，总是从特定的位点起始，将此位点称为复制起始位点(n)，这对于DNA复制是不可缺少的。大多数原核生物的染色体DNA分子只有一个on位点，而真核生物染色体DNA分子中有多个on。从复制起始位点开始复制出一个DNA分子或一个DNA片段的核苷酸序列称为一个复制单位，或一个复制子。只有一个复制起始位点的DNA分子，整个DNA分子就是一个复制子。而真核生物染色体DNA分子中有多个on，所以DNA分子的复制是由多个复制子共同完成的。染色体外遗传物质，包括病毒（噬菌体）DNA分子、线粒体DNA分子、叶绿体DNA分子和质粒DNA分子中一般只有一个ori，因此这些DNA分子是单复制子的。但是这些DNA分子可多次复制，所以在一个细胞内是多拷贝的。大多数DNA的复制是双向的，有些病毒（如腺病毒、中29噬菌体等)及线粒体DNA的复制是单向进行的。 二、RNA的组成与结构 RNA是一类重要的生物大分子，其组成类似于DNA，由4种核苷酸按照一定的顺序聚合而成。不同于DNA之处在于其核苷酸组成成分之一不是脱氧核糖而是核糖；组成RNA 的4种碱基中，胸腺嘧啶（T)被尿嘧啶（U)所替代。RNA分子在生物体内一般是单链的，但是往往通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。 在生物体内的RNA主要有基因组DNA转录产生的信使RNA (mRNA)、核糖体RNA (rRNA)和转运RNA (RNA)，在蛋白质的生物合成中起着重要作用。此外，生物体内还有不均一核RNA (HnRNA)、小核RNA (SnRNA)和小核仁RNA (SnoRNA)等。一切细胞的细胞质和细胞核中都含有RNA。此外，在部分病毒和一些噬菌体中也存在RNA，作为它们的遗传物质。 (一）mRNA mRNA (messenger RNA，信使RNA)在蛋白质生物合成过程中起着十分重要的作用，它是细胞内将遗传信息从DNA上传递到功能蛋白上的信使，是连接遗传信息与蛋白质合成的桥梁。基因的遗传信息首先在转录过程中从DNA转录到mRNA上，再以mRNA为模板按三联体密码将mRNA中的核苷酸顺序表达为蛋白质（多肽）中的氨基酸（图1-3)。所以生物体中稳定的mRNA是决定基因表达水平的一个重要因素，但是细胞内的mRNA —般是很不稳定的，代谢活跃，更新迅速，寿命短促。 图1-3 蛋白质生物合成过程 细胞中mRNA的含量虽然只占RNA总量的1%～5%，但是mRNA的种类繁多，一个哺乳类动物的细胞中就有成千上万种不同的mRNA分子。mRNA分子的大小也千差万别，小的只有几百个核苷酸，大的可达2万多个核苷酸。而且mRNA的结构在原核生物和真核生物细胞中是不完全一样的。 真核细胞的一个mRNA分子一般只携带一种肽链编码信息，合成一种多肽链，属于单顺反子的形式。真核生物的mRNA通常是先在细胞核内由DNA转录产生原始转录产物 mRNA前体（核不均-RNA，HnRNA)，然后再经过加工，成为成熟的mRNA，过膜转移到细胞质中。细胞质中成熟的真核生物mRNA的结构，一般是5，端有帽子结构和非翻译前导序列，3，端含非翻译序列和多聚腺苷酸[poly(A)]“尾巴”中间为翻译区（编码区)(图1-4)。“帽子”由7-甲基鸟嘌呤及三磷酸鸟苷组成，具有促进核蛋白体与mRNA结合和加速翻译起始速度的作用，也起着增强mRNA稳定性的作用。非翻译前导序列位于翻译起始密码子AUG之前，通常是不翻译的。poly(A)“尾巴”长度为20～200个腺苷酸，是以无模板的方式添加的，与mRNA从核内向胞质的转位及mRNA的稳定性有关。真核生物 mRNA的半衰期为1～2