作者：雷霆雯，李红梅
页数：90
出版社：科学出版社
出版日期：2021
ISBN：9787030688064
电子书格式：pdf/epub/txt
内容简介
本书分四章：章为实验须知；第二章介绍常用实验技术和方法，包括如何设置对照、吸量管的种类及使用、离心技术、分光光度技术、电泳技术、层析技术等；第三章是基本实验项目，通过基本实验增强学生对理论内容的理解，学会生物化学与分子生物学实验中常见的技术方法，培养学生的基本实验操作能力；第四章为综合性实验，这部分实验可培养学生综合分析和解决问题的能力。
本书可作为医学院校各专业的生物化学与分子生物学实验教材，也可作为从事相关领域工作者的参考书籍。
目录
第一章 实验须知 1
一、实验要求 1
二、实验报告要求 1
三、药品、试剂使用要求 2
四、实验安全注意事项 2
五、实验室清洁 3
第二章 常用实验技术和方法 4
一、实验对照的设置 4
二、吸量管的种类及使用 5
三、离心技术 7
四、分光光度技术 8
五、电泳技术 11
六、层析技术 13
第三章 基本实验项目 15
实验一 蛋白质的沉淀反应 15
实验二 蛋白质的两性反应和等电点测定 17
实验三 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 18
实验四 蛋白质定量实验 20
一、Folin-酚试剂法（Lowry法） 20
二、考马斯亮蓝染色法 22
三、BCA法 23
四、紫外分光光度测定法 24
实验五 凝胶层析分离血红蛋白和鱼精蛋白 25
实验六 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 27
实验七 氨基酸的薄层层析 32
实验八 核酸的定量测定 34
一、紫外吸收法 34
二、DNA的定量测定——二苯胺法 35
三、RNA的定量测定——地衣酚法 36
实验九 酵母RNA的提取及组分的鉴定 37
实验十 核酸的琼脂糖凝胶电泳 38
一、DNA的琼脂糖凝胶电泳 38
二、RNA的甲醛变性凝胶电泳 40
实验十一 影响酶活性的因素 42
一、温度对酶活性的影响 42
二、pH对酶活性的影响 43
三、激动剂和抑制剂对酶活性的影响 44
实验十二 丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的影响 45
实验十三 酶的米氏常数（Km）测定 47
一、碱性磷酸酶Km值的测定（双倒数作图法） 47
二、过氧化氢酶Km值测定（Hanes-Woolf作图法） 50
实验十四 乳酸脱氢酶的组分及作用 53
实验十五 血中葡萄糖含量的测定（邻甲苯胺法） 54
实验十六 饥饿和饱食对肝糖原含量的影响 56
实验十七 运动对乳酸含量的影响 57
一、运动对血中乳酸含量的影响 58
二、运动对尿乳酸含量的影响 59
实验十八 血清甘油三酯的测定 60
实验十九 血清总胆固醇含量测定 62
实验二十 酮体的生成与定性 64
实验二十一 转氨基作用（圆形纸层析鉴定） 65
第四章 综合性实验 70
实验二十二 血清白蛋白、γ球蛋白的分离纯化与鉴定 70
实验二十三 碱性磷酸酶的分离纯化和比活性测定 73
实验二十四 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验 77
实验二十五 碱裂解法提取质粒DNA 78
实验二十六 限制性内切核酸酶对质粒DNA的酶切 80
实验二十七 PCR扩增目的基因及鉴定 81
实验二十八 蛋白质印迹实验 84
主要参考文献 90
节选
第一章 实验须知 生物化学与分子生物学实验是生物化学教学的重要环节。通过实验，学生们可加深对理论内容的理解，学会生物化学与分子生物学实验中的基本操作技能，培养科学和严谨的态度，提高观察问题、分析问题和解决问题的能力，为今后学习医学、生命科学等相关课程打好基础。 一、实验要求 （1）进入实验室应该穿工装或白大褂，不得穿拖鞋，不得在实验室里吃食物，不得嬉戏打闹。 （2）实验前必须预习，明确实验目的、原理、操作关键步骤、注意事项及预期结果，计划好实验时间。 （3）实验操作时应严肃认真，注意观察，如实记录实验过程中出现的现象、数据与结果，并请带教老师当场审核签字。 （4）实验后及时整理总结，根据实验结果进行科学分析，按时书写并提交实验报告。 二、实验报告要求 撰写实验报告是实验的重要环节，如实认真地撰写实验报告是培养学生的科学思维及提高解决问题能力的重要方式。书写报告时应实事求是，字迹清楚、工整，不得用铅笔、红笔书写，杜绝抄袭。其基本内容包括以下几点。 1. 实验目的 通过本次实验应该掌握哪些知识、学会哪些实验技术。 2. 实验原理 即实验依据。可简单扼要地叙述。 3. 实验材料 主要的仪器及试剂。有的实验还需要样品，如血清、动物脏器等。 4. 实验步骤 需要翔实客观地进行操作。实验前应预习，做好时间安排、注明实验中操作的关键环节及防护措施等。可采用表格或流程图来表示。 5. 实验结果 是实验中出现的现象、数据等。要如实记录，并请带教老师审核签字。不能随便进行涂改。对于实验数据，最好归纳整理成各种图表（如标准曲线图、对照与实验组的比较表等）。 6. 分析讨论 是实验报告中最重要的一部分，可以反映学生的专业知识、分析问题和解决问题的能力。分析讨论是对实验结果进行正确的、有依据的、具有逻辑性的分析，如定性实验，通过分析实验结果应该得出简短而恰当的结论。讨论部分还包括如何解释所得结果与预期不一致；对出现的问题提出解决方案；对于实验设计的认识、体会和建议；也可提出自己独特的见解和想法。 三、药品、试剂使用要求 （1）使用药品和试剂时应仔细辨认标签，看清名称与浓度。 （2）取出药品或试剂后，立即盖好瓶塞并将药品或试剂瓶放回原处，瓶塞不要盖错，严防不同药品或试剂间的交叉污染。 （3）使用滴管时，滴管尖端朝下，不可倒置，以免试剂流入橡皮帽。 （4）用吸量管取液体时，应该用洗耳球吸，不能用嘴吸。 （5）称量药品或试剂时，不要将药品或试剂洒落在天平或操作台上，特别是具有强腐蚀性、强毒性的药品或试剂。 四、实验安全注意事项 （1）实验室内禁止吸烟。低沸点有机溶剂如需加热一定要用水浴，易燃易爆试剂的放置和操作都应远离火源。 （2）若遇有烟雾或有毒气体产生的实验，应在通风橱内进行。 （3）若实验室起火，应根据起火性质采取相应措施。例如，有机溶剂着火应采用沙土或石棉布灭火；金属钾、钠着火应用干砂、石墨粉灭火；电线或电器设备等着火，应先切断电源，再用四氯化碳灭火器灭火，禁止使用水或泡沫灭火器来扑灭燃烧的电线或电器。 （4）如遇酸碱灼伤皮肤，应立即用水冲洗，酸灼者再用饱和 NaHCO3溶液中和；碱灼者再用饱和H3BO3溶液中和；被氧化剂伤害者用Na2S2O3处理。严重时需处理后立即送医院救治。 （5）在抓取和固定动物时，要规范操作，确保人员安全。如遇动物咬伤，应及时冲洗伤口，用肥皂清洗，并在患处涂抹碘酒，如伤口较深较大，则应在处理完后去疾控中心打相关预防针。 （6）实验过程使用的生物材料，如微生物、动物组织、细胞培养液、血液、分泌物等都可能存在细菌、病毒感染的潜在危险，因此在处理各种生物材料时必须谨慎小心，做完实验后必须用肥皂、洗涤液或消毒液充分洗净双手。 （7）实验中产生的感染性培养物、菌株、相关生物制品及其他具有感染性的实验废弃物，应按医疗垃圾进行特定处理。 （8）强酸强碱应倒入专用小钵中，用水稀释冲淡后再用流水冲洗，或收集后由相关部门处理。 （9）有毒及有害物不能扔进垃圾箱或倒入水池，应由相关部门收集并做无害化处理。 （10）使用电器设备时不可用湿手操作，严防漏电。 （11）实验结束后，应关好水、电、门、窗、气阀门等才能离开实验室。 五、实验室清洁 （1）实验中所有固体废弃物（棉花、纱布、滤纸、移液吸头、凝胶等）必须丢入垃圾筒中，不可弃于桌上及水池里。 （2）实验完毕，所有公用物品应摆放整齐，清理擦拭干净自己的实验操作台，清洗试管、烧杯等，并倒置放好。 （3）每次实验结束，由值日小组轮流负责打扫当天实验室的卫生及安全检查。 第二章 常用实验技术和方法 一、实验对照的设置 科学研究中的对照是指对受试对象不施加实验因素或施加实验因素之前的状态。在生物化学实验中，正确地设置对照是认识事物的重要方法（即有比较才有鉴别），有时还是实验成败的关键。设置对照的基本要求是实验组与对照组除处理因素不同外，其他条件应尽量保持一致，即保持实验条件的均衡性或齐同条件对比的原则。设置对照的方式依不同的实验而异，本书中常出现的对照有下列四种类型。 （一）空白对照 空白对照是指在不加任何处理的“空白”条件下进行观察的对照。比色分析中，测定液中的许多试剂及其溶剂也可能有一定的吸光性，比色杯对光也有吸收、反射、散射等作用而影响透光。因此，用测定液所测得的吸光度是上述这些因素和被测物质吸光度的总结果，但凭此无法得出被测物的吸光度，若设一空白管，其比色杯和试剂、溶剂等与测定管完全相同，测出其吸光度后，测定管吸光度与空白管吸光度之差就是被测物的吸光度。实际工作中，直接用空白管调节仪器零点的意义即在此，因此，设置空白对照是实验中的重要手段。 （二）标准对照 标准对照是指以标准值或正常值作为对照，以及在所谓的标准条件下进行观察的对照。例如，比色分析中的标准管，用已知浓度的标准液，与测定管在同样条件下进行处理，然后测其吸光度，依比尔定律进行计算（或查标准曲线），得出测定管中物质的浓度。圆形纸层析法鉴定转氨基的实验中，测定液有2个色斑，其Rf 值不一，各斑是什么物质，必须借助在同样条件下已知氨基酸的Rf 值进行鉴定。这些标准品就是对被测物进行定量定性的对照。 （三）自身对照 自身对照指对照组和实验组都在同一研究对象上进行，不另设对照。自身对照方法简便，关键是看清实验处理前后现象变化的差异。实验处理前的对象状况为对照组，实验处理后的对象变化为实验组。例如，“运动对乳酸含量的影响”的实验，若只测定受试者运动之后的乳酸含量，就无法说明运动后乳酸的含量是升高还是降低，因而必须在运动之前就先测血或尿中的乳酸含量，作为对照，再测定运动后的乳酸含量，并与运动前进行比较，就可以知道运动对乳酸含量的影响了。对照和实验都在同一个体上进行，属于自身对照。 （四）相互对照 相互对照是指不单独设对照组，而是几个实验组相互对比对照，其中每一组既是实验组也是其他级别的对照组，由此得出相应的实验结论。例如，在“温度对酶活性的影响”实验中，4支试管所加的试剂完全相同，仅是各管所置的温度不同，而致反应的结果不同，其中任何一管都是其他3管的对照，反之，任何3管也是某一管的对照，将这些结果相互对照、相互比较才能得出酶活性与温度的关系。 二、吸量管的种类及使用 吸量管是用来精确转移一定体积溶液的量器。吸量管是生物化学实验中最常用的仪器之一，实验数据测定的准确度与吸量管的正确选择和使用密切相关。实验中最常用的是刻度吸量管和微量移液器两种。 （一）刻度吸量管 刻度吸量管可量取10ml、5ml、2ml、1ml、0.5ml的液体。其一般刻度包括尖端部分，如吸管上端标有“吹”或“快”字样时，在将所量液体全部放出后，还需要用洗耳球将管尖的残留液体吹出；如未标“吹”或“快”字样的吸管，则不必吹出管尖的残留液体。 使用吸量管时，中指和拇指拿住吸管上端，食指（示指）置吸管上端开口处，吸管保持垂直，用洗耳球将液体吸入管内，眼睛看着液面上升，吸完后用食指封住吸管上端开口处，慢慢移动食指，使液面下降到所需体积的刻度处后再次将开口封住，此时液体凹面与刻度线、视线应在同一水平面上，将吸管移入盛器中，使吸管尖端出口与盛器壁呈一定角度，放开食指，使吸管中的液体慢慢流入盛器中。 （二）移液器 移液器有不同规格，规格不同的移液器配有专门的聚丙烯塑料吸头，吸头通常是一次性的，在无菌实验使用前，吸头还需高压灭菌。常用的移液器有 1000μl、200μl、 20μl、10μl、5μl等规格。图2-1为移液器的结构及持法。 图2-1 移液器的结构及持法 1. 移液器的使用方法 （1）转动移液器调节旋钮或数字设定按钮设定取液值。在调整旋钮时，不要用力过猛，并应注意微量移液器显示的数值不应该超过其可调范围，如取液量超过微量移液器的可调范围，则应更换微量移液器。 （2）吸液（注意下按深度） 1）选择吸头放在移液器套筒上，稍加压力使之与套筒之间无空气间隙（漏气会导致吸液不准确）。 2）把按钮压至第一停点（图2-2A），竖直握持移液器，使吸头浸入液面下一定深度，缓慢平稳地松开按钮，吸入液体（图2-2B）。 （3）放液（注意下按深度） 1）将移液器吸头口贴到容器内壁下部并保持倾斜，这样可以避免因水张力堵住管口，平稳地把移液器按钮压到第一停点（图2-2C），再把移液器按钮压到第二停点以排出剩余液体（图2-2D）。 2）压住移液器按钮，同时提起移液器，使吸头贴容器壁擦过。松开按钮（图 2-2E），按卸吸头按钮除去吸头，将移液器放回移液器架。 图2-2 移液器的操作方法示意图 2. 移液器的使用注意事项 （1）吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞，造成漏气。 （2）为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。 （3）吸取浓度和黏度大的液体时，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验
